第一作者：Yunlong Su

通讯作者：彭永臻

通讯单位：北京工业大学

论文DOI：10.1016/j.scitotenv.2022.158973

Highlights：

•使用剩余污泥，在40天内建立PD，NO3-到NO2-的转化率为80.6 %。

•厌氧氨氧化菌在PD系统中的自富集显著提高了三个数量级。

•厌氧氨氧化活性的提高有利于PD/A工艺的有效建立。

•在PD反应器中，已知厌氧氨氧化菌属Candidatus Brocadia发生富集。

摘要

稳定的亚硝酸盐生成和快速启动是制约厌氧氨氧化工艺在主流城市污水处理中应用的主要瓶颈。在本研究中，利用污水处理厂的硝化/反硝化污泥，在40天内快速建立了将NO3--N还原为NO2--N的短程反硝化（PD）系统。NO3--N转化为NO2--N的转化率达到80.6 %。重要的是，随后在该系统中获得了厌氧氨氧化细菌的快速自我富集，导致在79天的操作后成功转化为高效的短程硝化/厌氧氨氧化（PD/A）工艺。当进水氨氮和硝酸盐氮浓度分别为45.9 mg/L和62.2 mg/L时，总氮去除率从12.4 %提高到90.0 %，相当于在没有接种厌氧氨氧化污泥的情况下，厌氧氨氧化活性显著提高到6.0 mgNH4+-N/g VSS/h。厌氧氨氧化菌的丰度从6.7×108增加到2.0×1011拷贝数/g干污泥。高通量测序结果显示，Candidatus Brocadia是唯一已知的厌氧氨氧化菌属，占PD/A阶段的1.08 %。PD的功能菌（认定为Thauera）从1.99 %富集到60.06 %，但在厌氧氨氧化活性提高的过程中下降到32.49 %。这表明，普通硝化/反硝化污泥形成的具有稳定NO2--N积累的PD系统促使了厌氧氨氧化细菌快速自我富集和高效脱氮，为厌氧氨氧化的规模化应用提供了新的见解。

引言

厌氧氨氧化（Anammox）技术在城市污水处理厂中具有节能和环保的优势，该技术无需消耗氧气和有机碳，直接将氨氮和亚硝酸盐氮转化为氮气。高效稳定的NO2--N生成是目前低浓度废水处理中厌氧氨氧化全面应用的主要瓶颈。厌氧氨氧化细菌对生长的严格要求和低产量限制了它的广泛应用。众所周知，厌氧氨氧化已应用于高NH4+-N浓度废水，如污泥消化液。然而，对于城市污水处理厂，温度随季节波动，在某些地方可降至10 °C以下，NH4+-N浓度相对较低，但有较多的可降解有机碳源，导致厌氧氨氧化细菌的生长和富集受到抑制。

厌氧氨氧化接种污泥通常用作接种污泥的一部分，以加速自养脱氮系统的启动。但在实际应用中会在一定程度上增加投资和操作的复杂性。相比之下，厌氧氨氧化细菌的原位自富集将是稳定运行的更实用和有效的策略。但是这仍然面临厌氧氨氧化菌低生长率的限制和来自硝化/反硝化过程的活性污泥的耗时开发。因此，作为厌氧氨氧化技术广泛应用的迫切问题，在低强度条件下接种和富集厌氧氨氧化菌在实践中需要一种高效和简便的替代方法。

目前，亚硝酸盐可以通过短程硝化作用（PN、NH4+→NO2-）获得。然而，短程硝化/厌氧氨氧化（PN/A）工艺仍然存在缺点，包括（1）PN工艺的控制更加复杂，并成为一体化PNA工艺的限速步骤；（2）对于主流城市污水，亚硝酸盐氧化菌（NOB）很难被完全淘洗或抑制；（3）过量的NO3--N需要进一步处理。PD被认为是一种高效稳定产生NO2--N的新方法。此外，厌氧氨氧化工艺产生的NO3--N可被反硝化细菌进一步还原，产生NO2-N。PD工艺利用有机碳生成NO2--N，消除了有机碳对厌氧氨氧化细菌的不利影响。因此，这为在PD条件下促进厌氧氨氧化菌的活性和生长提供了一种潜在的选择。然而，几乎没有关于在无厌氧氨氧化接种污泥的PD系统中培养缓慢生长的自养微生物的信息。

本研究通过将WWTP剩余污泥接种到硝化/反硝化工艺中，研究了厌氧氨氧化细菌快速发展和自我富集的可行性。分析了氮素转化的微生物机制和负责脱氮的功能菌活性。考察了传统脱氮工艺向新型PD/A一体化工艺转化过程中污泥的理化特性。最后，揭示了微生物群落的进化，以解释反硝化和厌氧氨氧化微生物在功能转化过程中的潜在相互作用。

图文导读

Fig. 1. (a) Long-term performance of nitrogen transformation for PD and self-enrichment of anammox bacteria; (b) variations in operating parameters of the system; (c) anammox and denitrification contribution to TN removal, and the loss of NH4+-N under anoxic.

（1）NO2--N的生成与PD/A的实现

短程反硝化过程中稳定的NO2--N生成对厌氧氨氧化性能的提高起着至关重要的作用。该系统的长期运行过程分为三个阶段（图1）。根据NO2--N的生产性能，将阶段Ⅰ分为第Ⅰ-1阶段和第Ⅰ-2阶段。在阶段I-1（第1-53天），NTR从第1天的3.1 %增加到第40天的80.6 %，然后在COD/NO3--N为2.5的条件下下降到58.3 %（图1a）。这主要是由于添加了过量的有机碳源，反硝化细菌可以利用足够的有机物将NO3--N还原为N2，在阶段I-2（第54-78天）中，COD/NO3--N从2.5调整到2.25（图1b），随着系统运行，NTR增加到78.4 %（图1a）。这表明成功实现了PD并向厌氧氨氧化细菌提供了底物NO2--N。

在第二阶段（第79-151天），在PD反应器中观察到氮损失。缺氧条件下NH4+-N（∆NH4+-N）的去除率从第76天的2.0 mg/L增加到第91天的19.2 mg/L。值得注意的是，在如此短的时间内，观察到废水中NH4+-N和NO2--N显著减少。出水中残留的NH4+-N和NO2--N分别从第76天的37.8 mg/L和42.1 mg/L下降到第91天的0.1 mg/L和0.5 mg/L（图1a）。据推测，厌氧氨氧化将负责在PD工艺发展后同时去除NH4+-N和NO2--N。此外，在第91-151天，NH4+-N去除效率增加，平均出水NH4+-N接近0 mg/L，NO2--N为1.0 mg/L，出水NO3--N水平非常低（4.7 mg/L）。有趣的是，∆NH4+-N高达21.6 mg/L，TN去除率迅速增加到90.0 %。这进一步说明厌氧氨氧化菌能够与PD协同作用以获得优异的脱氮性能。氮的质量平衡显示，厌氧氨氧化对TN去除的贡献高达85.0 %，表明自养脱氮途径在该系统中起主导作用（图1c）。

这主要是由于厌氧氨氧化菌在有限碳源条件下稳定和高效的NO2--N生产，而反硝化细菌不能与厌氧氨氧化菌竞争NO2--N，在这种情况下，厌氧氨氧化菌可以得以富集和保留。相反，厌氧氨氧化细菌的富集进一步增加了NTR，在第91-151天平均达到84.7 %（图1a）。这表明在厌氧氨氧化菌底物充足的情况下，厌氧氨氧化菌在悬浮污泥中逐渐富集。这主要归因于乙酸钠驱动的反硝化过程中NO2--N快速且大量的积累。有限的碳源有利于厌氧氨氧化菌与反硝化细菌竞争亚硝酸盐，阻止反硝化细菌的过度生长。随着脱氮性能的逐渐提高，HRT从8h逐渐缩短到4h，系统表现出稳定的脱氮性能。

Fig. 2. Transformation of nitrogen, and COD in the PD system during different periods with and without anammox activity, (a) day1, (b) day23, (c) day46 and (d) day74: the process of gradual realization of PD; (e) day131 and (f) day145: the duration of the reaction shortened with the self-enrichment and improved activity of anammox.

（2）PD与厌氧氨氧化协同作用下的氮素转化

通过不同时期的全周期结果，探索了PD系统在不同运行阶段的氮素转化特征（图2）。在接种硝化/反硝化活性污泥后，在COD/NO3--N为3.0时观察到完全的硝酸盐还原（图2a）。NO2--N积累至12.0 mg/L，然后在反应结束时减少。使用不同的碳源以及来自硝化/反硝化系统的接种污泥，在反硝化过程中观察到类似的NO2--N积累结果。在COD/NO3--N调节至2.5后，亚硝酸盐积累率得到提高，在阶段I-1中NO2--N累积量增加至27.2 mg/L（图2b）。应当注意的是，在出水中NO2--N达到35.9 mg/L，NO3--N为0.4 mg/L，但是NO2--N在60 min时积累到43.1 mg/L的峰值，然后下降，而NH4+-N没有下降。这表明，由于有机碳源过剩，NO2--N在60-240 min内被反硝化细菌进一步还原。因此，将COD/NO3--N进一步降低至2.25（图1b）。在阶段I-2中，出水中的NO2--N进一步增加到41.7 mg/L（图2c和d）。经过74天的运行，NO2--N的高度积累可以稳定维持，表明成功实现了短程反硝化。而NH4+-N在整个反应过程中几乎没有损失。这表明在适宜的COD/NO3--N条件下，WWTP硝化/反硝化活性污泥能够快速进行短程反硝化，这很可能与能够进行短程反硝化的功能菌的快速富集有关，为厌氧氨氧化菌的生长提供了关键环境。

Fig. 3. （a） Variations of nitrogen, COD in the typical cycle after the transformation from traditional nitrification/denitrification to partial denitrification/anammox; （b） variations of in-situ activity of PD and anammox.

在第79天观察到明显的NH4+-N损失。从宏观角度来看，尽管在启动阶段没有接种厌氧氨氧化接种污泥，但这被认为与厌氧氨氧化细菌的活性增加有关。这可以通过在第99天的典型周期中同时去除NH4+-N和NO2--N来解释（图3a）。在第一个0-40 min内，NO3--N和COD逐渐降低，相当于NO2--N在第20 min达到峰值，表明部分脱氮过程在第一个40 min内完成。与厌氧氨氧化反应相比，短程反硝化反应在0-20 min内的速率较高，厌氧氨氧化不会成为PDA过程的限速步骤。20 min后，NO2--N开始逐渐降低，表明厌氧氨氧化在20-40 min内的反应速率高于短程反硝化反应。有趣的是，在PD反应开始时同时观察到厌氧氨氧化活性，这表明该系统中有机碳源的存在不会抑制厌氧氨氧化细菌。这与以前的研究不同，以前的研究认为，厌氧氨氧化细菌可以在没有有机碳源的情况下以NH4+-N和NO2--N为底物进行培养和富集。

这可以从两个方面来解释。首先，由于缺乏有机碳源，异养细菌的生长受到限制；第二，尽管投加了COD/NO3--N高达2.25的有机碳源，PD工艺中产生的足够的NO2--N仍可被厌氧氨氧化菌用来氧化进水中的NH4+-N，而不是被异养反硝化菌还原。此外，很明显，厌氧氨氧化反应是该PDA系统中的限速步骤，可通过缩短HRT或增加氮负荷来实现厌氧氨氧化活性的进一步提高。然而，在整个操作过程中没有颗粒或生物膜形成，这表明厌氧氨氧化细菌可以在有机碳存在下在完全悬浮的污泥系统中随着活性的增加而快速富集。这证明了在环境温度下用来自WWTP的硝化/反硝化活性污泥通过厌氧氨氧化工艺实现高效脱氮的巨大潜力。随着HRT从8小时逐渐降低至6小时，然后降低至4小时，在此条件下证实了厌氧氨氧化细菌的逐渐富集和活性增加（图2e、f和3a）。

此外，原位活性分析证明了厌氧氨氧化菌自富集过程后，PD功能菌与厌氧氨氧化菌之间的高效协同作用。随着系统的长期运行，比NO2-N转化率（rNO2--N）从第1天的17.1 mg NO2--N/g VSS/h逐渐增加到第131天的95.0 mg NO2--N/g VSS/h。rNH4+-N在第74天仅为0.3 mg NO2--N/g VSS/h，在第131天增加到6.0 mg NO2--N/g VSS/h（图3b）。系统表现出明显的厌氧氨氧化活性后，室温下rNH4+-N呈现逐渐增加的趋势。这很可能与厌氧氨氧化细菌的不断富集有关。此外，在整个运行过程中，rNO2--N始终比rNH4+-N高得多，这表明PD可以快速生成厌氧氨氧化所需的NO2--N，而不是该系统中的限速步骤。总之，rNO2--N的逐渐增加对PD的成功实现和厌氧氨氧化细菌在PD系统中的成功自我富集起着关键作用。

Fig. 4. (a) Biomass growth and sludge settling ability during long-term operation; (b) EPS structure and composition with development of PD and following PDA process: variation of protein (PN), polysaccharide (PS) in different layers.

（3）厌氧氨氧化菌自富集过程中的污泥特性和EPS产生

在开发PD工艺之后，观察到了生物量的增长。MLSS和MLVSS分别从3.1g/L和2.0g/L逐渐增加到3.7g/L和3.1g/L。MLVSS/MLSS的比率在第77天显示出从63.6 %到83.0 %的明显增加（图4a）。这表明反硝化细菌逐渐富集，并随着硝酸盐的还原而导致NO2--N的大量积累。这与rNO2--N增加的结果一致。

然而，在PD过程的发展过程中，SVI在第63天从96.7 mL/g增加到132.4 mL/g（图4a）。说明污泥沉降能力有恶化的趋势，这主要与NO2--N的高积累对污泥沉降性能的影响有关。NO2--N对污泥沉降性能影响的机理有待进一步研究。然而，随着微生物群落的演替，观察到污泥沉降性的改善。厌氧氨氧化菌生长并达到高活性后，短程反硝化产生的NO2--N可主要被厌氧氨氧化菌利用，而不会在出水中积累。在第145天，SVI下降到88.4 mL/g，表明由于NO2--N对活性污泥的影响减轻，污泥沉降性能得到改善。

EPS已被广泛认为是细菌在各种操作条件下，尤其是在恶劣环境中的重要代谢产物。在本研究中，在达到PD的过程中，EPS从第1天的101.9 mg/g VSS增加到第42天的175.0 mg/g VSS，对应于NO2--N产+量的大幅增加。这很可能与细菌暴露于高浓度的NO2--N，导致EPS分泌增加有关。FNA（亚硝酸盐的质子化形式）是一种强杀菌剂，能增加EPS的分泌。此外，EPS的快速增加可能导致污泥沉降性能的恶化。此外，随着厌氧氨氧化去除TN的活性增加，EPS在第143天再次下降至106.5 mg/g VSS（图4b）。这可能与厌氧氨氧化细菌联合PD和厌氧氨氧化过程后NO2--N利用率增加有关，这与污泥沉降能力的提高是一致的。

此外，在这种完全絮凝的污泥系统中，观察到TB-EPS/LB-EPS（TB/LB）与污泥沉降性能之间的一致关系。TB/LB从第1天的1.8下降到第63天的0.8，然后在厌氧氨氧化细菌自我富集后增加到第143天的2.3（图4b）。前期研究表明，LB-EPS不利于污泥的沉降性能，相反，TB-EPS对污泥的沉降性能起重要作用，与本研究中TB/LB与SVI的关系一致。EPS可以促进生物膜形成，形成致密的厌氧氨氧化生物膜，这使得厌氧氨氧化在反应器中的停留时间更长。在这项研究中，在厌氧氨氧化菌的富集过程中没有观察到EPS分泌的增加。因此，厌氧氨氧化菌的富集不依赖于EPS分泌量，但良好的污泥沉降性能可以延长厌氧氨氧化菌在反应器中的停留时间，有利于厌氧氨氧化菌的富集。

总之，厌氧氨氧化细菌的自我富集在足够的沉降能力中起着重要作用。这反过来有利于缓慢生长的厌氧氨氧化细菌在系统中的有效保留，并提高了脱氮活性和稳定性。

Fig. 5. (a) Variation in the abundance of anammox bacteria, and (b) nitrogen removal pathways during different operational period.

（4）微生物群落演替

PD系统的长期运行性能和原位活性分析表明，厌氧氨氧化菌得到了成功富集并获得了较高的活性。通过q-PCR和高通量测序分析研究了该系统中各种功能微生物的进化。结果显示，经过143天的运行后，厌氧氨氧化细菌的丰度显著增加了三个数量级（从6.7×108到2.0×1011拷贝数/g干污泥）（图5a）。厌氧氨氧化细菌的生长率计算为0.11day-1，倍增时间为6.3天（第42-84天）。这可以很好地解释了TN去除效率和原位细菌活性的增加。这证明了厌氧氨氧化细菌在PD形成后在悬浮污泥系统中快速富集和有效滞留的可行性。在这种情况下，通过接种来自WWTP的硝化/反硝化污泥，由于PD/A工艺的快速转化，可以获得增强的TN去除（图5b）。对不同阶段的活性污泥进行高通量测序，以揭示微生物群落结构的变化。在门水平上，厌氧氨氧化细菌所属的Planctomycetes从第1天的0.47 %显著增加到第143天的3.20 %。有趣的是，随着PD的逐渐形成和亚硝酸盐的产生，Proteobacteria的丰度从第1天的25.30 %逐渐增加到第84天的68.79 %。而随着厌氧氨氧化细菌的自我富集，其转变为降低至第143天的44.77 %（图6b）。这可能是由于反硝化菌和厌氧氨氧化菌对NO2-N的竞争。此外，随着厌氧氨氧化菌的快速生长，代谢产物会分泌并释放到液体中，为不同类型的异养菌提供有机碳源。此外，α多样性指数Shannon也揭示了PD系统中厌氧氨氧化自富集过程中有趣的变化。Shannon从第1天的4.90下降到第84天的2.83，然后增加到第143天的3.94（图6a）。微生物多样性的下降可以解释为在NO2--N生成增加的过程中，具有PD能力的细菌被富集。然而，在厌氧氨氧化菌快速自我富集后，微生物多样性进一步增加，这可能是由于厌氧氨氧化菌和其他一些异养细菌利用代谢产物的复合物进行富集所致。

Fig. 6. (a) Microbial diversity; evolution of microbial community in the single system at (b) phylum level and (c) genus level

进一步分析了长期运行系统中微生物群落的属水平（图6c）。经过84天的运行，Thauera丰度从第1天的1.99 %显著增加到60.06 %，对应于PD工艺中NO2-N产生效率从3.1 %提高到81.3 %。据报道，在NO3--N还原过程中，Thauera在高NO2--N积累的短程反硝化作用中发挥了关键作用。值得注意的是，随着厌氧氨氧化细菌丰度的急剧增加，Thauera的丰度从第84天的60.06 %下降到第143天的32.49 %。推测厌氧氨氧化菌的富集导致了更多的大分子代谢产物，支持了单一系统中异养细菌的生长。据观察，异养细菌可能利用可溶性微生物产物作为厌氧氨氧化系统中生长的能源和碳源。此外，异养细菌尤其是异养反硝化细菌和厌氧氨氧化细菌之间的合作是通过PDA工艺实现稳定脱氮的关键，而合适的有机物负荷对于平衡的微生物群落至关重要。在本研究中，低COD/NO3--N控制在2.25，这不足以使反硝化细菌将NO3--N完全还原为N2，从而减少反硝化细菌和厌氧氨氧化细菌对底物NO3-N的竞争。

小结

本研究在接种了WWTP硝化/反硝化污泥的PD系统中获得了快速自富集的厌氧氨氧化细菌。在常温下实现了PD/A工艺转化，达到高效稳定的脱氮。主要结论如下:

①在40天内，高效的PD快速实现了NO3--N向NO2—N的80.6 %转化率，随后厌氧氨氧化细菌在单一系统中快速自我富集。

②在环境温度（17.2–27.7°C）下，经过79天的运行，证明了从PD到PD/A工艺的成功转换。在不接种厌氧氨氧化污泥的情况下，厌氧氨氧化的原位活性显著提高至6.0 mg NH4+-N/g VSS/h。

③在143天的运行过程中，厌氧氨氧化细菌的丰度从6.7×108个拷贝数/g干污泥显著增加到2.0 × 1011个拷贝数/g干污泥。在PD系统中仅检测到Candidatus_Brocadia。反硝化细菌Thauera在PD工艺启动过程中富集到60.06 %，但随着厌氧氨氧化菌和共生菌的增加，反硝化细菌的富集率呈下降趋势。

④尽管悬浮污泥系统中氮负荷和温度较低，但总氮去除率高达90 %，其中厌氧氨氧化对总氮去除的贡献率为85.0 %。